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Replikation und Reparaturmechanismen der DNA

Abstract

Bei der Zellteilung muss die gesamte DNA verdoppelt werden, damit aus einer Zelle zwei Tochterzellen mit identischem genetischen Material entstehen. Die Verdopplung der DNA (DNA-Replikation) erfordert, dass die Doppelhelixstruktur der DNA lokal aufgelöst wird. An jedem Einzelstrang können dann spezifische Proteine, u.a. DNA-Polymerasen, einen komplementären Tochterstrang synthetisieren. Es entstehen zwei Doppelstränge, die jeweils aus einem alten und einem neuen Strang zusammengesetzt sind.

Die DNA liegt im Zellkern an Proteine gebunden vor und ist sehr dicht gepackt. Für die Replikation, aber auch zum Ablesen der Gene, wird diese Verpackung zeitweise aufgelockert. Dieser Prozess ist streng reguliert.

Die DNA-Replikation beinhaltet zwar Kontrollmechanismen, um die genetische Information möglichst stabil zu halten, aber dennoch passieren Fehler. So werden z.B. falsche Basen eingebaut. Äußere Einflüsse sowie Vorgänge im Inneren der Zelle führen zu Veränderungen in der chemischen Struktur der DNA. Es ist also wichtig, dass Reparaturmechanismen existieren, die für ein ausreichendes Maß an Stabilität des Genoms sorgen. Fehlerhaft gepaarte Basen werden von spezialisierten Enzymen herausgeschnitten und ersetzt. So können sogar Brüche des Doppelstrangs zum Teil fehlerfrei repariert werden. Wird ein DNA-Schaden nicht repariert, kommt es zu einer Mutation im Genom.

Grundlagen der DNA-Replikation

Vor jeder Zellteilung muss der vollständige Chromosomensatz des Zellkerns exakt verdoppelt werden. Diesen Vorgang bezeichnet man als DNA-Replikation, bei der zwei identische Schwesterchromatiden jedes Chromosoms entstehen. Die Bausteine für die DNA-Synthese (ebenso wie für die RNA-Synthese) sind Nucleosidtriphosphate. Die Energie für die Synthese stammt aus der Spaltung der Phosphorsäureanhydridbindung zwischen α- und β-Phosphatgruppe dieser Nucleotide.

  • Definition: Herstellung einer Kopie eines DNA-Doppelstrangs während der Zellteilung (in der S-Phase des Zellzyklus)
  • Ziel: Nach der Zellteilung enthält jede Tochterzelle die identische genetische Information
  • Eigenschaften des Replikationsmechanismus
    • Semikonservativ
      • Der DNA-Doppelstrang wird in zwei Einzelstränge aufgespalten (Bildung einer Replikationsgabel)
      • Jeder Einzelstrang dient als Matrize für die Synthese eines komplementären neuen Strangs
      • Das Ergebnis der Replikation sind zwei identische doppelsträngige DNA-Moleküle, die jeweils aus einem alten (Elternstrang) und einem neu synthetisierten Tochterstrang bestehen
    • Bidirektional
      • Die Replikation geht in zwei Richtungen
      • An der Stelle, an der der DNA-Doppelstrang auseinander gewunden wird, bilden sich zwei "aktive" Replikationsgabeln.

Die Richtung der DNA-Replikation verläuft von 5' → 3'. Das bedeutet, dass an einen bereits vorhandenen Einzelstrang mit einer freien 3'OH-Gruppe das nächste Nucleotid angehängt wird!

Ablauf der DNA-Replikation

Die DNA-Replikation gliedert sich in drei Phasen: Die Initiation, die Elongation und die Termination . Es sind eine Vielzahl verschiedener Enzyme beteiligt.

An der DNA-Replikation beteiligte Proteine

Beteiligte Proteine Aufgabe Prokaryonten Eukaryonten
Helikase Entwinden lokaler Abschnitte der DNA-Doppelhelix (ATP-abhängige Reaktion) DnaB Mcm-Komplex
Topoisomerase

Entspiralisieren superspiralisierter DNA oder verändern ihrer räumlichen Struktur

Topoisomerasen I und Topoisomerasen II (Gyrasen)

Topoisomerasen I und II
Einzelstrang-bindende Proteine Verhindern der direkten Reassoziation der getrennten Einzelstränge SSB (Single Strand Binding Protein) RPA (Replication Protein A)
Primase (DNA-abhängige RNA-Polymerase) Synthese der RNA-Primer Primase (DnaG) Primaseaktivität als Bestandteil der DNA-Polymerase α
DNA-abhängige DNA-Polymerasen Verlängern des RNA-Primers um einige 50 bis 100 Nucleotide Polymerase α
Synthese des Folgestrangs Polymerase III Polymerase δ
Synthese des Leitstrangs Polymerase ε
Entfernen des Primers RNase H und Polymerase I (ihre 5'→3'-Exonucleaseaktivität) RNase H und FEN-1 (Flap Endonuclease-1)
Auffüllen der Lücke nach Entfernen des Primers Polymerase I Polymerase δ
Gleitring (Clamp) Verankern der Polymerase auf der DNA β-Untereinheit der Polymerase III PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen)
Ligase Verknüpfen der neu synthetisierten DNA-Fragmente (ATP- oder NAD+-abhängige Reaktion) DNA-Ligase DNA-Ligase
Telomerase Sorgt für die komplette Replikation der Enden linearer Chromosomen Telomerase

Gyrasehemmer
Gyrasehemmer sind Hemmstoffe der bakteriellen Topoisomerase II. Sie inhibieren sowohl die Initiation der DNA-Synthese als auch nach der Termination die Aufteilung der beiden Tochterchromosomen auf die zwei neuen Zellen. Daher werden sie als Antibiotika eingesetzt (z.B. Ciprofloxacin, Nalidixinsäure).

1. Initiation

2. Elongation

  • Definition: DNA-Synthesephase
  • Beteiligte Proteine: Unter anderem Primase, DNA-Polymerase , Ligase
  • Ablauf
    1. Primersynthese
    2. DNA-Synthese
      • Synthesemechanismus
        • Prinzip: Anknüpfen des nächsten zum Matrizenstrang komplementären Desoxynucleotids (dATP, dGTP, dCTP oder dTTP) an die freie 3'OH-Gruppe des zu verlängernden DNA-Strangs (Bildung einer Esterbindung!)
        • Details
          1. DNA-Polymerase knüpft die Esterbindung: Katalysiert den nucleophilen Angriff der 3'OH-Gruppe auf das α-Phosphat des anzuknüpfenden Desoxyribonucleosidtriphosphats
          2. Einzelstrang wird um ein Nucleotid verlängert
          3. Pyrophosphat (PPi) wird freigesetzt
          4. Pyrophosphat wird dann von einer Pyrophosphatase in zwei Phosphate gespalten
        • Konsequenz aus Mechanismus und Richtung der Synthese sowie DNA-Struktur
          • Die DNA-Replikation erfolgt nur an dem Einzelstrang kontinuierlich, der ein freies 3'OH-Ende hat (Leitstrang, leading strand).
            • Für den Leitstrang wird nur ein Primer benötigt.
          • Am anderen Einzelstrang (Folgestrang, lagging strand) verläuft die Polymerisation auch in 5'→3'-Richtung!
          • Okazaki-Fragmente: Damit die Replikation an beiden Strängen gleichzeitig ablaufen kann, wird der Folgestrang diskontinuierlich, das heißt in Abschnitten von 1000 bis 2000 Nucleotiden synthetisiert
            • Für jeden dieser DNA-Abschnitte wird ein jeweiliger Primer benötigt.
            • Der Primer wird jeweils an der Replikationsgabel synthetisiert
    3. Proofreading (Korrekturlesen): Manche Polymerasen besitzen eine 3'→5'-Exonucleaseaktivität und entfernen falsch gepaarte Nucleotide
    4. Entfernen der Primer: Die Aktivität der RNase H und eine 5'→3'-Exonucleaseaktivität der prokaryontischen DNA-Polymerase I bzw. das Enzym FEN-1 (Flap Endonuclease-1) bei Eukaryonten sind notwendig, um die RNA-Primer vollständig zu entfernen
    5. Auffüllen der Lücken: DNA-Polymerase füllt die Lücken mit zum Elternstrang komplementären Nucleotiden auf bis die freien Enden aufeinander stoßen
    6. Verbinden der Enden
      • Eine Ligase verbindet (ligiert) die freien Enden des neu synthetisierten Tochterstrangs
      • Ligasereaktion
        1. Die Ligase überträgt einen AMP-Rest auf das 5'-Phosphatende des einen der zu verbindenden DNA-Fragmente
        2. AMP wird abgespalten und das 5'-Phosphatende mit dem 3'OH-Ende des anderen Fragments verbunden

Die Topoisomerase I spaltet einen DNA-Strang und benötigt kein ATP dafür, die Topoisomerase II spaltet beide DNA-Stränge und benötigt dafür ATP!

Bei der DNA-Synthese kommt es zu einem nucleophilen Angriff der 3'OH-Gruppe des bestehenden DNA-Strangs auf das α-Phosphat des anzuknüpfenden Desoxyribonucleosidtriphosphats!

3. Termination

  • Definition: Beendigung der DNA-Replikation, wenn zwei Replikationsblasen aufeinander treffen. Für zirkuläre und lineare DNA-Moleküle gibt es verschiedene Terminationsmechanismen.
  • Mechanismus: Stopp der Replikation wird ausgelöst, indem Terminationsproteine an sogenannte Terminationssequenzen binden

Telomere

Telomere sind die Enden der linearen menschlichen Chromosomen. Sie codieren für keine Strukturgene, sondern schützen vor dem Verlust der Strukturgene. Mit jeder Zellteilung nimmt jedoch in somatischen Zellen die Telomerlänge ab, wodurch diese Zellen eine limitierte Lebensspanne haben. Die Telomere werden deshalb mit dem Prozess der Zellalterung in Zusammenhang gebracht.

  • Definition: Nicht-codierende DNA-Abschnitte aus einigen 1.000 Basenpaaren an den Enden von linearen Chromosomen, die bei Menschen aus Sequenzwiederholungen von sechs Nucleotiden bestehen
  • Funktion: Verhindern den Verlust von Strukturgenen während der Replikation linearer DNA-Doppelstränge
    • Der Leitstrang kann komplett synthetisiert werden
    • Das 5'-Ende des Folgestrangs wird kürzer
  • Telomerase

Mechanismen der DNA-Schädigung

Bei der DNA-Replikation treten Fehler auf. Des Weiteren ist die DNA chemisch nicht komplett stabil: Einige Bindungen sind anfällig für spontane Veränderungen. Hinzu kommen DNA-Schäden durch Einwirkungen von außen (chemische oder physikalische Noxen). Das alles können Ursachen für Mutationen sein, d.h. Veränderungen im Genom einer Zelle. Die gespeicherte genetische Information wird geändert, wodurch ein veränderter Phänotyp entstehen kann. Für das Individuum sind Mutationen unerwünscht und werden - wenn möglich - repariert. Mutationen sind aber andererseits auch die Grundlage für Evolution. Sie ermöglichen einer Population eine bessere Anpassung an äußere Umstände, wenn dadurch angepasstere Individuen entstehen.

Endogene Ursachen für Fehler in der DNA-Sequenz

Chorea Huntington (Veitstanz)
Die Chorea Huntington ist eine Trinucleotid-Repeat-Erkrankung, bei der im Gen für das Protein Huntingtin die Nucleotidabfolge -CAG- weit über die durchschnittliche Anzahl (9 bis 35 Repeats des Tripletts) hinaus vermehrt ist. CAG codiert für die Aminosäure Glutamin, die bei Erkrankten so häufig hintereinander in das Protein eingebaut wird, dass das Protein im Gehirn aggregiert. Die auffälligsten Symptome dieser neurologischen Erkrankung sind plötzliche, nicht willkürlich beeinflussbare Bewegungen z.B. der Finger (Klavierspielerbewegungen) und des Gesichts.

Exogene Ursachen für Fehler in der DNA-Sequenz

  • Chemische Noxen
    • Alkylierende Substanzen
      • Chemische Verbindungen, die Basen alkylieren (methylieren oder ethylieren), sodass sie mit anderen Basen paaren als üblich
      • Zum Beispiel entsteht O6-Ethylguanin durch Alkylierung aus Guanin und paart mit Thymin statt mit Cytosin
        • Beispiele: Senfgas, Dimethylnitrosamin, Dimethylsulfat
    • Interkalierende Substanzen: Chemische Verbindungen, die sich zwischen die gestapelten Basen in die DNA einlagern
      • Konsequenz
        • Replikation stoppt
        • Risiko für Strangbrüche steigt
      • Beispiele: Ethidiumbromid, Acridinfarbstoffe, Actinomycin D
  • Physikalische Noxen
    • UV-Strahlung
      • Energiereiche Strahlung, z.B. UVB-Strahlung, die dazu führen kann, dass benachbarte Pyrimidinbasen Dimere bilden
      • Meistens sind das Thymindimere, zwischen denen sich ein Cyclobutanring bildet
      • Die Replikation stoppt an dieser Stelle.
    • Ionisierende Strahlung
      • Energiereiche Strahlung, die zu Einzel- und Doppelstrangbrüchen in der DNA führen kann
      • Außerdem kommt es zur verstärkten Bildung von Radikalen, z.B. Sauerstoff- und Hydroxylradikale, die die Basen chemisch verändern können

Typische Ursachen von DNA-Schäden:
Desaminierung von Cytosin zu UracilUracil paart dann mit Adenin!
UV-Strahlung → Thymindimere!
Ionisierende Strahlung → Radikalbildung → DNA-Schäden!

Mechanismen der DNA-Reparatur

Trotz Fehler bei der DNA-Reparatur und DNA-Schäden durch endogene und exogene Noxen liegt die spontane Mutationsrate nur bei 1x10-9, d.h. pro Zellteilung wird im Durchschnitt eine von 1 Milliarden Basen verändert. Der Grund dafür ist einerseits die Proofreading-Funktion einiger DNA-Polymerasen , durch die Fehler bei der DNA-Replikation in den überwiegenden Fällen direkt korrigiert werden. Andererseits gibt es spezifische DNA-Reparaturmechanismen, die dafür sorgen, dass die Basensequenz relativ stabil bleibt. Die Möglichkeiten der Zelle/des Organismus, DNA-Schäden zu reparieren, beruhen meist auf der Sequenzinformation aus dem intakten DNA-Strang.

Mismatch-Reparatur

Mismatch = Fehlpaarung der Basen, d.h. es wurde ein falsches Nucleotid eingebaut.

Direkte Reparatur von Basen

  • Definition: Reparatur beschädigter Base (nicht ihr Austausch)
  • Mechanismus 1
    • Photolyase spaltet UV-Licht- und FADH-abhängig Thymindimere
    • Dieses Enzym kommt in Säugetierzellen nicht vor, sondern nur in manchen Bakterien und niedrigen Eukaryonten
  • Mechanismus 2
    • O6-Alkylguanin-DNA-Alkyltransferase ist in der Lage O6-Alkylguanine (O6-Methylguanin und O6-Ethylguanin) wieder in Guanin zu überführen
    • Das Enzym wird dadurch irreversibel inaktiviert

Basenexzisionsreparatur

  • Definition: Entfernung desaminierter oder oxidierter Basen durch Ausschneiden des fehlerhaften Desoxyribonucleotids
  • Enzyme: DNA-Glycosylase, AP-Endonuclease, Phosphodiesterase, DNA-Polymerase β, DNA-Ligase
  • Mechanismus
    1. Erkennung der beschädigten Base durch DNA-Glycosylase und Entfernen der Base → AP-Stelle
    2. Entfernen des Desoxyribosephosphats durch AP-Endonuclease und Phosphodiesterase
    3. Füllen der Lücke durch die Polymerase
    4. Verbinden der Enden durch die Ligase

Nucleotidexzisionsreparatur

  • Definition: Reparatur von DNA-Schäden, die die Raumstruktur der DNA verändern (z.B. bei Bildung von Thymindimeren), durch Ausschneiden mehrerer Nucleotide
  • Enzyme: Proteinkomplex zur Erkennung des DNA-Schadens, Transkriptionsfaktor TFIIH (Helikaseaktivität), Endonucleasen, DNA-Polymerase δ und ε, DNA-Ligase
  • Mechanismus
    1. Erkennung der veränderten DNA-Struktur
    2. Auftrennung der doppelsträngigen DNA in Einzelstränge durch TFIIH (etwa über eine Sequenz von 25 Basenpaaren)
    3. Herausschneiden eines ca. 30 Basenpaare langen Oligonucleotids des fehlerhaften DNA-Tochterstrangs durch Endonucleasen
    4. Füllen der Lücke durch die Polymerase
    5. Verbinden der Enden durch die Ligase

Xeroderma pigmentosum
Bei dieser seltenen Hauterkrankung ist durch einen Defekt des Nucleotidexzisions-Reparatursystems die Haut extrem lichtempfindlich. Wenn das Sonnenlicht nicht komplett gemieden wird, kommt es zu Pigmentverschiebungen und schließlich zur Entstehung von Tumoren.

Reparatur von Doppelstrangbrüchen

  • Definition: Reparatur von Brüchen beider DNA-Strängen, die die Stabilität des Genoms bedrohen, z.B. durch ionisierende Strahlung oder bei der Bildung von Radikalen im Zellstoffwechsel.
  • Voraussetzung: Bindung eines Proteinkomplexes an die freiliegenden Chromosomenenden → Aktivierung der Proteinkinase ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) → Aktivierung von p53 → Anhalten des Zellzyklus
  • Mechanismen (Details s. Tabelle)
Homologe Rekombination Nicht-homologe Endverknüpfung
Definition Reparatur durch Austausch von homologen Abschnitten zwischen zwei DNA-Molekülen (Schwesterchromatiden) Reparatur durch Verknüpfung von zwei DNA-Fragmentenden
Zeitpunkt im Zellzyklus Späte S-Phase oder G2-Phase Jederzeit möglich
Fehlerfreie Reparatur Ja, da der Defekt anhand des komplementären Strangs im Schwesterchromatid behoben werden kann Nein, sehr fehleranfällig, da keine fehlerfreie Matrize vorhanden

BRCA1 und BRCA2
An der Reparatur von Doppelstrangbrüchen sind viele Proteine beteiligt. Für die homologe Rekombination wichtig sind u.a. die Proteine BRCA1 und BRCA2. Mutationen in den Genen für diese Proteine stehen in Verbindung mit einem deutlich erhöhten Risiko, an Brustkrebs zu erkranken.

Wiederholungsfragen zum Kapitel Replikation und Reparaturmechanismen der DNA

Grundlagen der DNA-Replikation

Was versteht man unter DNA-Replikation und welche Prinzipien liegen ihr zugrunde?

Ablauf der DNA-Replikation

In welche Phasen kann die Replikation untergliedert werden?

An welcher Stelle im Genom beginnt die Replikation?

Welche Aufgabe hat das Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) während der DNA-Replikation?

Welches Enzym katalysiert bei der DNA-Replikation die Auftrennung des DNA-Doppelstrangs?

Was ist der Unterschied zwischen Topoisomerase I und II?

Beschreibe den DNA-Synthesemechanismus!

Was sind Okazaki-Fragmente?

Wie werden die bei Abschluss der DNA-Replikation fehlenden Esterbindungen im DNA-Rückgrat gebildet?

Telomere

Was sind Telomere?

Welche Funktion hat die Telomerase?

Mechanismen der DNA-Schädigung

Wie kann UV-Strahlung zu Schäden in der DNA-Sequenz führen?

Was passiert bei der oxidativen Desaminierung von Basen der DNA? Nenne Beispiele!

Mechanismen der DNA-Reparatur

Welche Aufgabe übernimmt die DNA-Glycosylase bei der Basenexzisionsreparatur?

Welcher Reparaturmechanismus setzt bei Pyrimidindimeren ein?

Eine Sammlung von allgemeineren und offeneren Fragen zu den verschiedenen prüfungsrelevanten Themen findest du im Kapitel Beispielfragen aus dem mündlichen Physikum.