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Genexpression und Transkription

Abstract

Das Genom enthält die vererbbare Information über Aufbau und Funktion einer Zelle oder eines Organismus. Diese Information ist in der Abfolge der Basen der DNA gespeichert. Ein relativ kleiner Anteil der DNA codiert dabei für Proteine und Ribonucleinsäuren (RNAs), der Großteil des Genoms besteht jedoch aus Sequenzen, denen keine klare Funktion zugeordnet werden kann. Die Umsetzung der Information der DNA in funktionelle Moleküle – also RNA und Proteine – wird als Genexpression bezeichnet. Zur Synthese von Proteinen läuft die Genexpression in zwei Stufen ab: Im Prozess der Transkription wird zuerst eine Kopie der DNA in Form von RNA hergestellt. Danach wird die Kopie verwendet, um in der Translation ein Protein zu synthetisieren.

Die entscheidenden Enzyme während der Transkription sind die DNA-abhängigen RNA-Polymerasen. Sie synthetisieren RNA auf Grundlage der auf der DNA codierten Gene, die dazu spezielle Startstellen (Promotoren) aufweisen, an denen die Transkription beginnt. Für die Erkennung der Promotorregion werden Hilfsproteine – sogenannte Transkriptionsfaktoren – benötigt. Die RNA-Polymerase bewegt sich dann entlang der DNA und liest den einen Strang des DNA-Doppelstrangs ab, auf dessen Grundlage sie RNA synthetisiert, bis sie das Ende des abzulesenden DNA-Abschnitts erreicht. Dieser ist durch eine Terminationsstelle gekennzeichnet. Bei Eukaryonten wird das entstandene Primärtranskript noch weiter modifiziert, um dann z.B. für die Proteinsynthese zur Verfügung zu stehen.

Die Genexpression wird auf allen Ebenen streng reguliert. Manche Gene werden in allen Zellen exprimiert und sind als sog. Haushaltsgene (engl. housekeeping genes) für die grundlegende Funktion einer Zelle notwendig – man spricht von konstitutiver Expression. Andere Gene wiederum sind nur in bestimmten Zellen aktiv – ihre Expression wird über vielfältige Mechanismen reguliert. Gene können entsprechend aktiviert oder stillgelegt werden, d.h. ihre Transkription findet je nach Anwesenheit spezifischer DNA-bindender Proteine statt. Aber auch nach der Transkription kann die entstandene mRNA durch verschiedene Mechanismen abgebaut werden, bevor sie für die Proteinsynthese verwendet wird. Daneben existieren Regulationsmechanismen auf Translationsebene. Obwohl also jede Zelle eines Organismus die gleiche DNA enthält, bewirkt die regulierte Expression bestimmter Gene, dass Zellen sich spezialisieren und ganz unterschiedliche Funktionen übernehmen, z.B. Muskelzellen oder Leberzellen werden können.

Überblick

Die DNA beinhaltet die Informationen für die Aminosäuresequenz aller Proteine einer Zelle (Strukturgene). Des Weiteren befinden sich auf der DNA Kontrollelemente, die die Steuerung der Expression dieser Strukturgene ermöglichen.

Bei der Proteinbiosynthese wird die DNA zunächst in mRNA umgeschrieben (Transkription) und diese dann in eine Aminosäurekette übersetzt (Translation)!

Grundlagen

Die DNA dient bei der Transkription als Vorlage für die Herstellung eines komplementären RNA-Moleküls. Von den beiden Einzelsträngen der doppelsträngigen DNA wird nur einer abgelesen.

RNA-Polymerasen

Die Reaktionen der Transkription werden von den DNA-abhängigen RNA-Polymerasen katalysiert. Bei Eukaryonten gibt es vier verschiedene RNA-Polymerasetypen - drei im Zellkern und eine im Mitochondrium. Sie erkennen jeweils unterschiedliche Promotortypen und transkribieren demnach verschiedene Genarten.

  • Aufbau: Sind aus zwei großen Untereinheiten mit zahlreichen Polypeptidketten aufgebaut
  • Funktionsmechanismus: Synthetisieren von 5' nach 3', lesen also den DNA-Strang von 3' nach 5' ab
RNA-Polymerasetyp Transkripte Ort

RNA-Polymerase I

Zellkern

RNA-Polymerase II

  • Euchromatischer Bereich des Nucleus

RNA-Polymerase III

Mitochondriale RNA-Polymerase

Mitochondrium

Die RNA-Polymerase II transkribiert alle Gene, die für Proteine codieren!

Die ribosomalen RNAs (rRNAs) werden im Nucleolus transkribiert!

Transkriptionsfaktoren

Die RNA-Polymerasen benötigen Hilfsproteine, um die Promotoren der zu transkribierenden Gene zu finden. Man unterscheidet dabei die allgemeinen (generellen) Transkriptionsfaktoren von den spezifischen Transkriptionsfaktoren. Die Transkriptionsfaktoren spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation der Transkription.

DNA-bindende Proteine

Proteine wie die Transkriptionsfaktoren, die an die DNA binden, benötigen dafür spezielle Proteindomänen - auch Strukturmotive genannt. Diese Strukturmotive verwenden meist eine α-Helix oder ein β-Faltblatt, um in der großen Furche der DNA zu binden. Insbesondere Transkriptionsfaktoren besitzen DNA-bindende Domänen, über die sie mit spezifischen DNA-Abschnitten wechselwirken können, um ihre Funktion auszuüben. Mittlerweile sind zahlreiche Strukturmotive solcher DNA-Bindedomänen bekannt. Einige wichtige Beispiele sind die Zinkfinger-Domäne, der Leucin-Zipper, das Helix-Loop-Helix-Motiv sowie die Homöobox.

  • Zinkfinger
    • Kennzeichen: Zink-Ion, das meist durch zwei Histidin- und zwei Cysteinreste gebunden (koordiniert) wird
    • DNA-Bindung: Mehrere Zinkfingerdomänen sind oft kettenartig hintereinander geschaltet und binden mit einer α-Helix in der großen Furche der DNA
  • Leucin-Zipper
    • Kennzeichen
      • Zwei lange unabhängige α-Helices, die über ihre hydrophoben Abschnitte aneinander binden und eine superspiralisierte Struktur ausbilden
      • Da etwa jeder siebte Aminosäurerest Leucin ist und diese Reste reißverschlussartig ineinander greifen, nennt man dieses Strukturmotiv Leucin-Zipper
    • DNA-Bindung: Die nicht-hydrophoben Abschnitte der α-Helices enthalten viele basische Reste (Arginin, Lysin) zur Interaktion mit der großen Furche der DNA
  • Helix-Loop-Helix
    • Kennzeichen
      • Zwei Polypeptidketten, die meist aus einer kurzen und einer langen α-Helix bestehen, die über eine flexible Schleife (einen Loop; enthält keine Sekundärstruktur) miteinander verbunden sind
      • Über die basischen Abschnitte der α-Helices dimerisieren die zwei Polypeptidketten.
    • DNA-Bindung: Die kurzen basischen α-Helices gehen Wechselwirkungen mit der DNA ein
  • Homöobox-Domäne (mit Helix-Turn-Helix-Motiv)
    • Kennzeichen: Eine Polypeptidkette mit drei kurzen hintereinander liegenden α-Helices, wobei die dritte α-Helix über eine Drehung (turn) senkrecht zu den ersten beiden α-Helices steht
    • DNA-Bindung: Die dritte, relativ basische α-Helix bindet als Erkennungshelix v.a. an Basen in der großen Furche der DNA.

Ein wichtiges Strukturmotiv von DNA-bindenden Proteinen ist eine α-Helix mit vielen basischen Aminosäureresten!

Ablauf der Transkription

Die Transkription wird in drei Phasen eingeteilt: Die Initiation, die Elongation und die Termination.

  1. Initiation: Beginn der Transkription durch Bildung des Initiationskomplexes und Entwindung der DNA
    1. Bildung des Präinitiationskomplexes (auch: geschlossener Initiationskomplex) durch Bindung verschiedener allgemeiner Transkriptionsfaktoren sowie der RNA-Polymerase an bestimmte Regionen innerhalb des Promotors (z.B. TATA-Box, CAAT-Box, GC-Box)
      • Beispiel: TATA-Box (AT-reiche Sequenz innerhalb des Promotors )
      1. Anlagerung von TFIID mit dem TATA-Box-bindenden Protein (TBP) und weiteren Faktoren an die TATA-Region des Matrizenstrangs
      2. Stabilisierung durch die weitere Anlagerung von TFIIA und TFIIB
      3. Bindung der RNA-Polymerase II zusammen mit TFIIF an den Promotor
      4. Bindung von TFIIE Und TFIIH
    2. Bildung der Transkriptionsblase durch Entwindung der DNA-Doppelhelix auf einer Länge von 10-12 Basen (offener Initiationskomplex)
    3. Beginn der Transkription
      • Die RNA-Synthese startet schon während der Initiation
  2. Elongation: Verlängerung des RNA-Strangs
    • Synthesemechanismus
      1. Nucleophiler Angriff des Sauerstoffatoms der 3'OH-Gruppe des wachsenden RNA-Strangs auf das α-Phosphat des nächsten, komplementären Nucleosidtriphosphats (NTP), das angefügt werden soll
      2. Entstehung einer Phosphodiesterbindung
      3. Freisetzung von Pyrophosphat
  3. Termination
    • Auch für die Termination werden eine Reihe von Proteinfaktoren benötigt
    • Über den Ablauf bei Eukaryonten ist bisher wenig bekannt

Bei der Transkription findet eine Basenpaarung zwischen DNA und RNA statt, wobei in der RNA Uracil (statt Thymin) mit Adenin in der DNA paart! Cytosin paart nach wie vor mit Guanin!

RNA und DNA paaren antiparallel: Wo bei dem einen Molekül das 5'-Ende ist, ist bei dem anderen Molekül das 3'-Ende, und umgekehrt. Trotzdem schreibt man die Basensequenz in beiden Fällen jeweils in 5'→3'-Richtung!

Topoisomerase-Hemmstoffe
Die Topoisomerasen beheben die Spannungen, die entstehen, wenn die DNA-Doppelhelix aufgewunden wird. Hemmt man sie, so führen die Spannungen zu Brüchen in der DNA; die DNA-Replikation sowie die Transkription werden damit verhindert. Diesen Mechanismus macht man sich bei der Behandlung bösartiger Tumoren zunutze - Topoisomerase-Hemmstoffe sind häufig eingesetzte Zytostatika! So wird zum Beispiel der Topoisomerase-I-Hemmer Topotecan zur Behandlung eines metastasierenden Ovarialkarzinoms eingesetzt.

Posttranskriptionale Modifikation (RNA-Prozessierung)

Die Produkte der Transkription sind verschiedene Arten von RNA (s.o. Tabelle RNA-Polymerasen und ihre Transkripte). Eine davon ist die von der RNA-Polymerase II synthetisierte hnRNA. Aus hnRNA entsteht durch posttranskriptionale Modifikationen im Zellkern die reife mRNA. Zu diesen Modifikationen zählen Capping, Splicing, Polyadenylierung sowie RNA-Editing .

Capping

  • Definition: Anhängen einer Kopfgruppe („Cap“) am 5'-Ende der hnRNA
    • Die neu entstehende hnRNA besitzt anfangs ein Triphosphat an ihrem 5'-Ende
  • Ablauf
    1. Abspaltung der 5'-Phosphatgruppe durch eine RNA-Triphosphatase
      • Es entsteht ein 5'-Diphosphatende
    2. Anfügen eines GMP-Rests (entsteht aus GTP unter Abspaltung von Pyrophosphat) an das 5'-Diphosphatende der hnRNA durch eine Guanylyltransferase
    3. Methylierung des endständigen Guaninrests an der Position 7 sowie eventuell von ein oder zwei Riboseresten der hnRNA mit S-Adenosylmethionin (SAM) als Methylgruppendonor
  • Ergebnis: Alle Kopfgruppen enthalten 7-Methylguanylat, d.h. ein Guanosin mit einer Methylgruppe am N7-Atom, das über drei Phosphatreste an die 5'-Ribose gebunden ist.
  • Funktion

Das 5'-Ende jeder wachsenden hnRNA-Kette und auch jeder reifen mRNA enthält eine Kopfgruppe aus methyliertem Guanin als „Cap“!

Polyadenylierung

  • Definition: Anhängen eines Schwanzes aus Adenosinmonophosphaten (sog. Polyadenylatschwanz) an das 3'-Ende der hnRNA
  • Ablauf
    1. Eine Endonuclease erkennt anhand von spezifischen RNA-Sequenzen die Polyadenylierungsstelle und spaltet die mRNA dort
    2. Poly(A)-Polymerase bindet an die Schnittstelle und fügt ATP-abhängig etwa 50-250 Adenosinmonophosphate an
  • Funktion
    • Erhöhung der Stabilität (Schutz vor Abbau)
    • Initiation der Translation

Das 3'-Ende jeder reifen mRNA enthält einen Polyadenylatschwanz!

Splicing („Spleißen“)

  • Definition: Herausschneiden der Introns aus der hnRNA und direkte Verknüpfung der Exons durch zwei Umesterungsreaktionen
  • Ablauf
    1. Bildung des Spleißosoms an der Exon-Intron-Grenze
      • Spleißosom
        • Komplex aus:
          • Verschiedenen snRNAs (small nuclear RNAs), die an Proteine gebunden vorliegen und die sog. snRNPs (small nuclear ribonucleoproteins) bilden
          • Vielen weiteren kleinen Proteinen
          • Der zu modifizierenden hnRNA
      • Beteiligte Sequenzabschnitte auf der hnRNA:
        • Exon-Intron-Grenzen: Gekennzeichnet durch spezifische Basensequenzen (sog. Konsensussequenzen) auf der RNA
          • 5'-Spleißstelle
          • 3'-Spleißstelle
        • Verzweigungsstelle: Innerhalb des Introns liegendes Adeninnucleotid, an dem sich eine lassoähnliche Struktur ausbildet (s.u.)
        • Pyrimidinreiche Sequenz vor der 3'-Spleißstelle
    2. Erste Umesterung
      • Nucleophiler Angriff der 2'OH-Gruppe am Adeninnucleotid der Verzweigungsstelle auf die Phosphodiesterbindung an der 5'-Spleißstelle
      • Öffnung der Exon-Intron-Grenze an der 5'-Spleißstelle: Es bildet sich vorübergehend eine lassoähnliche Struktur mit einer 2'→5'-Phosphodiesterbindung aus, die die zwei Enden, die zusammengefügt werden sollen, in unmittelbare Nähe zueinander bringt
    3. Zweite Umesterung
      • Öffnung der Exon-Intron-Grenze an der 3'-Spleißstelle
      • Zusammenfügen der Exon-Enden
  • Funktion: Herausschneiden der Introns, sodass die entstehende mRNA nur noch relevante Informationen in Form von Exons enthält

Die Exons eines Gens sind die codierenden Abschnitte, die Introns werden beim Splicing aus der hnRNA herausgeschnitten!

RNA-Editing

  • Definition: Veränderung der Basensequenz der RNA durch Insertion, Deletion oder Modifikation von einzelnen Basen (unabhängig vom Splicing)
  • Funktion: Zusätzliche Möglichkeit der Erzeugung von verschiedenen Proteinen
  • Beispiele

Alternatives Splicing

  • Definition: Herausschneiden von Introns der hnRNA mit variablem Zusammenfügen der Exons.
  • Ablauf: Wie das Splicing, mit zusätzlichen Splicefaktoren, die die Auswahl der Spliceorte festlegen
  • Funktion
    • Aus einem Gen können verschiedene Proteine hergestellt werden: Erhöhung der Informationsdichte der DNA
    • Entstehung von neuen Proteinen wird erleichtert: Schnellere Anpassung an veränderte Lebensbedingungen

Die „Ein-Gen-ein-Enzym-Hypothese“ gilt bei Eukaryonten nicht! Aus einem Gen können durch alternatives Spleißen eine Vielzahl von Proteinen entstehen!

Regulation und Hemmstoffe der Transkription

Sowohl Transkription als auch Proteinbiosynthese sind mit großem Energieverbrauch verbunden. Deshalb wird die Genexpression stark reguliert. Eine weitere Funktion der spezifischen Regulation der Genexpression ist die Möglichkeit, die Aktivität der Genprodukte (meist Proteine) zu regulieren. Auf diese Weise können Zellen auf Veränderungen ihrer Umwelt reagieren, z.B. auf eine veränderte Nährstoffzufuhr.

Zu Epigenetik, Chromatin Remodeling und Histonmodifikation siehe auch: Humangenetik (Vorklinik).

Regulation der Transkription

Manche Gene werden kontinuierlich abgelesen - man spricht von konstitutiver Expression. Andere Gene werden reguliert exprimiert. Die Regulation erfolgt durch die Bindung von bestimmten Proteinen an spezifische DNA-Sequenzen. Meistens wird dadurch die Genexpression unterdrückt (Repression). In einigen Fällen kann die Transkription allerdings auch durch die Bindung von Proteinen an die DNA gesteigert werden.

  • Repressor: Ein DNA-bindendes Protein, das die Transkription eines Gens oder Operons unterdrückt, indem es an Silencersequenzen eines Gens bzw. die Operatorregion eines Operons bindet, bis ein Signal diese Bindung aufhebt (negative Transkriptionskontrolle)
  • Aktivator: Im Zusammenhang mit der Genregulation ein DNA-bindendes Protein, das die Transkription eines Gens oder Operons stimuliert, indem es an Enhancersequenzen eines Gens bzw. die Promotorregion eines Operons bindet, bis ein Signal diese Bindung aufhebt (positive Transkriptionskontrolle)

Das Operonmodell als Beispiel prokaryontischer Genregulation

Die Expressionsregulation wurde zuerst bei E. coli untersucht. Regulatorische Sequenzen im bakteriellen Genom sorgen für die Expression des Gens für das Enzym β-Galactosidase, wenn der Zucker Lactose als Energiequelle zur Verfügung steht. Zusätzlich werden weitere Proteine synthetisiert, die mit der Verstoffwechslung von Lactose zusammen hängen. Es handelt sich also um die koordinierte Expression mehrerer Gene.

  • Definition: Modell zur Beschreibung des Mechanismus der Genregulation in Prokaryonten
  • Funktion: Anpassung an veränderte Umweltbedingungen durch gleichzeitig stattfindende Erhöhung der Expression bestimmter zusammengehöriger Gene
  • Beispiel: lac-Operon
    • Transkriptionseinheit von Genen für Enzyme des Lactosestoffwechsels, die nur in Anwesenheit von Lactose exprimiert werden
    • Bestandteile (in der Reihenfolge im Genom)
      • Regulatorgen lacI: Gehört nicht direkt zum lac-Operon, aber codiert für ein Repressorprotein, das in Abwesenheit von Lactose an den lac-Operator bindet und die Transkription verhindert
      • Promotor: Bindungsstelle für CAP (englisch für catabolite activating protein; ein Aktivatorprotein) und die RNA-Polymerase in der Transkription
      • Operator
        • Bindestelle für den Repressor (s.o.)
        • Die Operatorstelle überlappt mit dem Promotor
      • lacZ: Gen für β-Galactosidase
      • lacY: Gen für Permease
      • lacA: Gen für Transacetylase
    • Regulation
      • Anwesenheit von Glucose und Abwesenheit von Lactose
        • Der lac-Repressor bindet an den Operator, das lac-Operon wird reprimiert
        • Es befinden sich nur sehr wenige Moleküle β-Galactosidase in der Zelle
      • Abwesenheit von Glucose, aber Anwesenheit von Lactose
        • Lactose bzw. ihr zelluläres Umwandlungsprodukt Allolactose bindet an den Repressor
        • Dadurch wird der Repressor inaktiviert und bindet nicht weiter am Operator
        • Der Promotor ist frei für die Polymerase; die Strukturgene können abgelesen werden
        • Die Zahl der β-Galactosidasemoleküle in der Zelle steigt um das 1000-fache (Lactose dient also als Induktor)

Im lac-Operon bindet der Repressor an den Operator und verhindert in Abwesenheit von Lactose die Transkription der Gene des Operons.

Eukaryontische Gene sind nicht in Operons organisiert!

Eukaryontische Genregulation

Bei Eukaryonten ist die Regulation der Genexpression wesentlich komplizierter als bei Prokaryonten. Das liegt einerseits daran, dass das Genom von Eukaryonten wesentlich größer ist als das von Prokaryonten. Andererseits liegt die DNA im eukaryontischen Genom im Zellkern stark kondensiert und als Chromatin verpackt vor. Dadurch ist sie weniger leicht zugänglich als prokaryontische DNA. Eine Gemeinsamkeit ist jedoch die große Bedeutung von Aktivatoren und Repressoren, die spezifische DNA-Sequenzen binden und die Genexpression steigern bzw. hemmen.

  • Distale regulatorische Elemente: DNA-Sequenzen, die die Transkriptionsrate eines Gens beeinflussen können
    • Enhancer (engl. to enhance = „steigern“)
      • Kurze, etwa 20bp lange DNA-Sequenz
      • Meist ein Palindrom oder eine Tandemsequenz
      • Erhöhen die Transkriptionsrate, wenn spezifische Transkriptionsfaktoren an sie binden
        • Diese Transkriptionsfaktoren können unabhängig vorliegen oder von bestimmten Liganden abhängig sein
          • Ligandenabhängige Transkriptionsfaktoren: Intrazelluläre Hormonrezeptoren, die nach Hormonbindung im Zellkern mit Enhancersequenzen wechselwirken und die Transkriptionsrate der von ihnen kontrollierten Gene erhöhen (für eine Übersicht über Hormonrezeptoren siehe auch: Lernkarte Signaltransduktion)
      • Beispiel für eine Enhancer-Sequenz: HRE (Hypoxia-Response-Element)
        • Der spezifische Transkriptionsfaktor HIF (Hypoxie-induzierter Faktor) bindet bei Sauerstoffmangel (Hypoxie) an die HRE-Sequenz und induziert bestimmte Zielgene, die für die Hypoxieantwort wichtig sind, z.B. Expression von EPO und VEGF.
        • Bei Normoxie (Sauerstoff ist in ausreichendem Maß vorhanden) wird HIF von der HIF-Prolylhydroxylase hydroxyliert. Hydroxy-HIF wird ubiquitiniert und im Proteasom abgebaut und kann die Expression seiner Zielgene nicht steigern
    • Silencer (engl. to silence = „dämpfen“): Vermindern die Transkriptionsrate, wenn spezifische Repressoren an sie binden

Hemmstoffe der Transkription

Hemmstoffe der Transkription sind starke Zellgifte (z.B. α-Amanitin - das Gift des Knollenblätterpilzes), können jedoch teilweise auch als Antibiotika eingesetzt werden.

Hemmstoff Wirkmechanismus Vorkommen/Nutzen
α-Amanitin
  • Gift des Knollenblätterpilzes
Rifampicin
Actinomycin D
  • Hemmt die Transkription durch Einlagerung in die DNA (Interkalation) und durch Verformung der DNA

Wiederholungsfragen zum Kapitel Genexpression und Transkription

Grundlagen

Wie unterscheiden sich Introns von Exons?

Welche Substrate baut die RNA-Polymerase bei der Transkription ein?

Wo und durch welches Enzym wird ribosomale RNA transkribiert?

Was wird als Zinkfinger bezeichnet? Welche Funktion hat dieser?

Ablauf der Transkription

Was ist ein Präinitiationskomplex? Nenne ein Beispiel!

Wie verhalten sich 5'- und 3'-Ende von DNA und RNA zueinander?

Posttranskriptionale Modifikation

Welche RNA wird als Vorläufer für die reife mRNA gebildet?

Was versteht man unter Capping? Wie ist das „cap“ aufgebaut?

Welcher Vorgang wird als Splicing bezeichnet?

Was ist ein Spleißosom?

Beschreibe den chemischen Reaktionsmechanismus der ersten Umesterung des Splicings!

Was wird unter RNA-Editing verstanden? Erkläre es am Beispiel des A-zu-I-Editing!

Woran liegt es, dass aus der gleichen mRNA in Leber und Enterozyt unterschiedliches Apolipoprotein B entsteht?

Was wird als alternatives Splicing bezeichnet?

Regulation und Hemmstoffe der Transkription

Welche Rolle spielen distale regulatorische Elemente in der Genexpression?

Erkläre die Enhancer-Funktion des Hypoxia-Response-Elements!

Welche Hemmstoffe der Transkription kennst du?

Eine Sammlung von allgemeineren und offeneren Fragen zu den verschiedenen prüfungsrelevanten Themen findest du im Kapitel Beispielfragen aus dem mündlichen Physikum.